流式平台预约服务介绍

医学部流式细胞仪公共服务平台目前由两台流式细胞仪以及专业操作员组成，提供流式分析和分选的技术服务。分析型流式细胞仪是BD公司的FACS CALIBUR，配有双激光和四通道检测器，最高满足四色分析；分选型流式细胞仪是BD公司的FACS Aria II，配备了三激光和九个通道的荧光检测器，最高满足九色分析以及最多同时对四种细胞的分选。

分析型流式细胞仪Calibur的特点及服务

仪器参数：

一．服务项目（包括且不限于下列）

1.细胞表面/胞桨/核的特异性抗原检测（蛋白质，RNA，DNA）

2.细胞活性检测

3.细胞的增殖/凋亡分析

4.细胞内/外细胞因子检测

5.DNA含量与细胞周期检测

6.胞膜电位测定

7.胞内钙离子测定

8.细胞内pH测定

9.细胞内活性氧检测

10.蛋白质磷酸化检测

二、特别注意

（1）自备样品，详见样品制备部分。

（2）自带已格式化的U盘或光碟，数据资料恕不提供网络传输。

三、样本制备

1.理想样品浓度：调至1—10 X 10⁵ cells/ml。

2.样品体积：至少需1-2ml/ 管。

3.过滤条件：35-55 m的尼龙筛网。上机前务必去除样品中之细胞团块，过滤以免管路堵塞。

4.流式分析的样品是单细胞悬浮液，而且大部分样品都需经荧光染色。表面抗原荧光染色的方法大致有两种：直接免疫荧光、间接免疫荧光染色。可至BD公司网站下载染色方法 http://www.bdtwn.com.tw/bdb/10-5-4-1.html

5.多染色实验请务必准备未经染色（或染有isotype）及单染(单阳)样品，以便做检测前校正用。

6.未依规定所造成的仪器损坏由准备者负责赔偿。

未依规定致使实验数据不完整，本平台恕不负责。

四、预约方式

1.服务时间：工作日全天，如有特殊时间段需求请与操作员联系安排。

2.预约方式: 可电话预约、微信预约或医学部科研管理平台预约。

3.上机地点和联系方式：医学部A7-337；联系电话：0755-26919942

4.校内用户预约流程：

（a）提前两天预约，并确认安排；

（b）按预约时间准时上机完成分析（务必准时，以免影响后续安排）；

（c）登记样本信息和分析数量等（六个月统计结算一次）；

（d）收到平台发放的使用统计收费表，请一个星期内完成缴费；

（e）缴费至A7-907周国卫老师处结算费用，刷公务卡，开具发票。

5.校外用户预约流程：

（a）电话或微信仪器管理员，至少提前一周预约，并确认安排；

（b）填写样本信息和分析要求，按预约时间上机完成分析；

（c）并进行检测登记；

（d）到管理员处结算费用；

（e）至A7-907周国卫老师处结算费用，可刷公务卡、信用卡和银行卡等，开具发票。

6.取消预约：最迟于预约时段前一天电话或微信取消预约，由操作员确认。

五. 收费标准：

开机费100元，然后按照测试样本量收费单色16元/测试；双色24元/测试；三色32元/测试。校内半价；学部部内1/4。

六. 服务举例：

周期分析：

分选型流式细胞仪AriaⅡ的特点及服务

仪器参数：

一、服务项目

1.无菌细胞分选: 各种细胞系、原代细胞、肿瘤组织单细胞悬液等；

2.特殊细胞分选或其他项目：请联系管理员（0755-26919942）；

3.本仪器以分选为主，不承接流式分析实验，建议事先使用其它流式细胞仪确认细胞阳性染色比例。如特殊情况确需本仪器分析的，请联系管理员。

二、特别注意

1.安全性问题：由于在分选过程中，样本可能通过液滴震荡产生气溶胶，所以不接受会传播人类病原菌的生物有害样本，也不接受含放射性生物样品。

2.应知道细胞的大小与形态，以便选择分选用喷嘴。所分选细胞的直径最好小于喷嘴直径的1/5，至少小于1/3。细胞的形态也会影响了分选的结果，理论上越接近于球形的细胞，分选过程中的剪切力对细胞造成的伤害就越小。形态特殊的细胞应选择较大的喷嘴，以减轻分选过程对细胞造成的伤害。自带已格式化的U盘或光碟拷贝数据，数据资料恕不提供网络传输。

三、样本制备

1.样本制备基本流程：

7.获取细胞悬液→荧光抗体染色→调整细胞浓度（1~10 X 10⁶ cells/ml）→过滤细胞→移入流式管→避光置冰上运至分选室→上机检测并设定分选条件→分选细胞→上机回测，检测纯度。

注：分选前的细胞一定要过滤过（一般用300目滤网），否则会堵机器的。

2.分选所用的细胞染色方法与分析所用方法基本相同，但需要注意以下几点：

a）保证样本的无菌状态，因为分选得到的细胞还要继续培养；

b）不能使用固定剂固定细胞，因为活细胞经固定剂处理后即死亡；

c）保证上机样品为单细胞悬液；

d）准备充足的细胞；

e）建议分选上样管中的缓冲液使用含2% FBS的PBS，普通培养基中的酚红可能会干扰分选；若用培养基的话，颜色不能太深，血清浓度不能超过2%，否则粘性太大影响分选。

f）如细胞分选后需再次培养，请准备含血清的收集管，在分选前交操作员。建议在5ml离心管中加入1-2ml血清及其它必需组分，保证分选完毕时血清浓度大于5%；

g）如要分选GFP等转染的样品，请提供未经转染的相同细胞为阴性对照；

h）如要做多重荧光染色标本的分选，请提供各种单一荧光染色的标本；

i）如要去除死细胞，在不影响后续实验前提下，可以加入7-AAD或是PI；

j）快速简便的样本处理有利于分选：处理好的样本尽快上机，分选好的细胞尽快下一步实验，如果要分选多个样本，建议一次处理一个，估计可能的上机时间后，再处理第二个样本。

按流式细胞分选要求制备细胞样品，保证实验样品的绝对无菌，并同时提供阴性对照样品。

四.常见问题

Q1. 上机样品需要溶在何种溶液中？是否可以就直接放在原本培养的培养基中？

Ans: 建议不要放培养基中，因为Phenol Red可能会影响分选的结果，可先尝试使用含2%FBS 或BSA的PBS作为分选缓冲液。如要求更好的细胞存活率，按分选细胞的不同，选择不同的分选缓冲液。

1.淋巴细胞（HBSS配方中的阳离子可增进细胞的生存力。如果这些细胞并非易于群集细胞，可以选用没有EDTA的缓冲液）。

a)1 mM EDTA, 25mM Hepes (pH7.0) and 0.5% - 2% BSA in 1× PBS (without Ca²⁺ and Mg2+)

b)1× HBSS (without phenol red) with 1% BSA

c)0.5% - 2% BSA in PBS(without Ca²⁺ and Mg²⁺)

2.贴壁细胞（以Trypsin处理后去准备单细胞悬浮液时，待细胞变圆(切记不可过度作用)，以适量含5%血清培养液收取细胞，并均匀地打散细胞悬浮液。离心后，用分选缓冲液调整细胞浓度。如果需要的话可以提高EDTA的浓度(至5mM)以避免细胞重新黏聚）。

a）5 mM EDTA, 25mM Hepes (pH7.0) and 0.5% - 2% BSA in 1× PBS (without Ca²⁺ and Mg²⁺)

b）0.5-2% BSA in PBS(without Ca²⁺ and Mg²⁺)

3.含有高比例死细胞的样本（这些配方可减少因死细胞释放出来的DNA所造成的细胞黏聚现象。）

5mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 25mM Hepes (pH7.0), 25-50 μg/mL DNAase I and 0.5% - 2% BSA in 1× PBS (without Ca²⁺ and Mg²⁺)

4.建议询问有经验者（使用相同细胞进行过分选）的分选缓冲液配方。

Q2. 如果细胞要再培养，会污染吗？

Ans: 分选所用的所有溶液都经高温高压灭菌，流式分选仪管路使用70%乙醇定期清洗，仪器所在房间在每次分选前紫外灭菌，最后在细胞培养基中加入抗生素，可将污染机率降至很低。

Q3. 如果我想在分选后拿到1×10⁶的细胞我应该一开始准备多少细胞去做分选？

Ans: 假设你要的细胞只占总数的10%，则你所需准备的细胞数如下公式: 1×10⁶=10%× 50%回收率× 20×10⁶(起始细胞数)，所以你需要准备2×10⁷细胞。高速分选、纯度模式(purity vs. yield mode)、部分细胞黏附于上样管壁、部分细胞用于样本分析、长时间分选过程中细胞的死亡等等，对会降低回收率。50%回收率是一个一般的参考值。

Q4. 通常做一次细胞分选需要多久时间？ 

Ans: 分选的过程有三个步骤，分别为设定分选区域、分选及分选后的分析。设定分选区域约需15-20分钟。分选的时间决定于细胞数目，虽然机器的分选速度最高可达70,000细胞/sec，但为得到最佳分选结果，我们通常设定分选速度不超过10,000-20,000细胞/秒。因此，如欲分选2×10⁷细胞，其所需分选时间最少为17-34分钟。分选后约需15-20分钟去回测及分析结果。所以，最少约需1-1.2小时去分选2×10⁷细胞，若细胞密度不够或分选细胞比例较小，这个时间会大大延长。

Q5. 一个样品可以同时分选出几种细胞?

Ans: FACSAria可以从一个样品中最多同时分选出四种不同的细胞。

Q6. 可以同时使用多少参数进行细胞分选？

Ans: FACSAria最多可以根据11个参数去定义及分选一群细胞 (检测488 nm 激光对应的5种荧光信号及SSC和FSC，监测633 nm 激光对应的2种荧光信号，检测355nm 激光对应的2种荧光信号，另有四个可扩充的空白通道)。

Q7. 分选后细胞的纯度有多少？

Ans: 如果所分选细胞可以和其他细胞群较好的区分，通常可以达到95%以上的纯度。

Q8. 如果阳性的细胞占总数的1%以下，还可以做分选吗？

Ans: 可以，但是低含量细胞的分选会导致低纯度及低回收率。因此，我们建议使用者事先富集你感兴趣的细胞。细胞富集的方式可以是正选：如用磁珠法富集你感兴趣的细胞；也可以是负选，如利用nylon wool去除B细胞，或磁珠法去除不要的细胞。

Q9. 分选时所使用的管子有哪些？

Ans: 上样一般使用5ml带盖流式管(BD Falcon tube #352003)；收集可以使用下面这2种管，14ml圆底离心管(BD Falcon tube #352059) (最多双路分选)，5ml带盖流式管(Falcon tube #352003) (最多四路分选)。

五. 预约方式

1.服务时间：工作日全天，如有特殊时间段需求请与操作员联系安排。

2.预约方式: 可电话预约、微信预约或医学部科研管理平台预约。

3.上机地点和联系方式：医学部A7-334；联系电话：0755-26919942

4.校内用户预约流程：

（a）提前两天预约，并确认安排；

（b）按预约时间准时上机完成分选，请务必准时，以免影响后续安排；

（c）登记样本信息和分析数量等（六个月统计结算一次）；

（d）收到平台发放的使用统计收费表，请一个星期内完成缴费；

（e）缴费至A7-907周国卫老师处结算费用，刷公务卡，开具发票。

5.校外用户预约流程：

（a）电话或微信仪器管理员，至少提前一周预约，并确认安排；

（b）填写样本信息和分析要求，按预约时间上机完成分选；

（c）并进行检测登记；

（d）到管理员处结算费用；

（e）至A7-907周国卫老师处结算费用，可刷公务卡、信用卡和银行卡等，开具发票。

6.取消预约：最迟于预约时段前一天电话或微信取消预约，由操作员确认。

六. 收费标准：

开机费500元，然后按照每小时500元收费。校内半价250元/小时；学部部内1/4费用125元/小时。